Исследователи разработали систему для одновременной оценки копий SMN1, SMN2
Согласно исследованию , цифровая ПЦР, которая одновременно выявляет дефекты гена SMN1 и количество копий SMN2 для диагностики спинальной мышечной атрофии (СМА) в программах скрининга новорожденных, по точности соответствует стандартным методам, но является более быстрой и менее затратной.
Новая методика также позволила обнаружить одну копию SMN1 у здоровых новорожденных, чего не могут сделать стандартные методы, что подтверждает диагноз СМА у младенцев, имеющих одну дефектную копию SMN1 и другие мутации, вызывающие заболевание.
«Цифровая ПЦР предлагает практичную и эффективную альтернативу скринингу СМА в [скрининге новорожденных], позволяя одновременно анализировать количество копий SMN1 и SMN2 , а также повышая скорость и точность диагностики», — написали исследователи. Исследование «Скрининг новорожденных на спинальную мышечную атрофию: потенциал метода цифровой полимеразной цепной реакции» было опубликовано в журнале Molecular Genetics and Metabolism .
Большинство типов СМА вызваны дефектами в гене SMN1 , который нарушает выработку SMN, белка, необходимого для двигательных нейронов, нервных клеток, которые контролируют движение мышц. Недостаток SMN ухудшает функцию двигательных нейронов, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости и истощению . Почти во всех случаях части гена SMN1 , кодирующие SMN — экзон 7 и часто экзон 8 — отсутствуют.
Клетки также имеют второй, почти идентичный ген SMN2 , который может частично компенсировать потерю SMN1 . Количество копий SMN2 , которое варьируется, обычно определяет тяжесть заболевания и его прогрессирование.
Поскольку раннее лечение улучшает двигательную функцию и увеличивает выживаемость, во многих странах были запущены программы скрининга новорожденных (NBS) для выявления дефектов SMN1 сразу при рождении или до появления симптомов. В рамках этого процесса кровь собирается из небольшого укола пятки, высушивается в виде пятна на фильтровальной бумаге, затем извлекается и проверяется ДНК.
Два стандартных метода генетического скрининга для определения количества копий SMN1 и SMN2 — это количественная ПЦР (кПЦР) для количественной оценки специфических последовательностей ДНК и мультиплексная амплификация лигатурных зондов (MLPA), которая позволяет выявить отсутствующие или дополнительные фрагменты ДНК.
В Японии текущие программы NBS используют qPCR на образцах сухих пятен крови для обнаружения отсутствующего экзона 7 в обеих копиях гена SMN1 , по одной унаследованной от каждого родителя. Затем MLPA определяет количество копий экзонов 7 и 8 в SMN1 и SMN2 , чтобы поставить окончательный диагноз . Однако этот метод требует много времени и не может обнаружить СМА у пациентов с одной копией SMN1 , например, у тех, у кого делеция экзона 7 SMN1 и другие мутации, вызывающие заболевание.
«Чтобы устранить эти ограничения, существует острая необходимость в методах, которые повышают точность диагностики и сокращают время постановки окончательного диагноза», — пишут исследователи из Университета Кумамото в Японии, которые разработали цифровую систему ПЦР для одновременной оценки количества копий SMN1 и SMN2 с целью сокращения времени диагностики и повышения точности.
Образцы сухих пятен крови были собраны у шести пациентов со СМА и 386 здоровых новорожденных с помощью процедуры укола пятки через четыре-шесть дней после рождения. Для сравнения с цифровой ПЦР, количество копий SMN1 и SMN2 было предварительно определено с помощью MLPA.
Используя цифровую ПЦР, 1,3% здоровых новорожденных имели одну копию SMN1 , 91,2% — две копии, 6,7% — три и 0,8% — четыре. Что касается SMN2 , то у 6,9% здоровых новорожденных не было ни одной копии, у 32,6% была одна копия, у 59,8% — две, у 1,8% — три, и ни у одного не было четырех.
«Метод цифровой ПЦР позволяет точно идентифицировать новорожденных с помощью одной копии экзона 7 SMN 1», — пишут исследователи.
Как и ожидалось, ни при использовании цифровой ПЦР, ни при использовании MLPA ни у одного из шести пациентов не было обнаружено SMN1 , в то время как у троих было две копии SMN2 , а у троих — три копии.
При сравнении цифровой ПЦР с MLPA количество копий SMN1 и SMN2 было одинаковым у всех шести пациентов. Поскольку не было амплификации SMN1 ни в одном образце, чувствительность теста, способность правильно идентифицировать людей с СМА, и его специфичность, способность правильно идентифицировать людей без СМА, составили 100%.
Реагенты, используемые в цифровой ПЦР, менее дороги, чем те, которые используются в количественной ПЦР, «что делает цифровую ПЦР жизнеспособным вариантом для широкого внедрения в программы [скрининга новорожденных] в будущем», — пишут исследователи.
«Это исследование продемонстрировало эффективность использования цифровой ПЦР для [скрининга новорожденных] SMA с [образцами сухих пятен крови]».
Согласно исследованию , цифровая ПЦР, которая одновременно выявляет дефекты гена SMN1 и количество копий SMN2 для диагностики спинальной мышечной атрофии (СМА) в программах скрининга новорожденных, по точности соответствует стандартным методам, но является более быстрой и менее затратной.
Новая методика также позволила обнаружить одну копию SMN1 у здоровых новорожденных, чего не могут сделать стандартные методы, что подтверждает диагноз СМА у младенцев, имеющих одну дефектную копию SMN1 и другие мутации, вызывающие заболевание.
«Цифровая ПЦР предлагает практичную и эффективную альтернативу скринингу СМА в [скрининге новорожденных], позволяя одновременно анализировать количество копий SMN1 и SMN2 , а также повышая скорость и точность диагностики», — написали исследователи. Исследование «Скрининг новорожденных на спинальную мышечную атрофию: потенциал метода цифровой полимеразной цепной реакции» было опубликовано в журнале Molecular Genetics and Metabolism .
Большинство типов СМА вызваны дефектами в гене SMN1 , который нарушает выработку SMN, белка, необходимого для двигательных нейронов, нервных клеток, которые контролируют движение мышц. Недостаток SMN ухудшает функцию двигательных нейронов, что приводит к прогрессирующей мышечной слабости и истощению . Почти во всех случаях части гена SMN1 , кодирующие SMN — экзон 7 и часто экзон 8 — отсутствуют.
Клетки также имеют второй, почти идентичный ген SMN2 , который может частично компенсировать потерю SMN1 . Количество копий SMN2 , которое варьируется, обычно определяет тяжесть заболевания и его прогрессирование.
Поскольку раннее лечение улучшает двигательную функцию и увеличивает выживаемость, во многих странах были запущены программы скрининга новорожденных (NBS) для выявления дефектов SMN1 сразу при рождении или до появления симптомов. В рамках этого процесса кровь собирается из небольшого укола пятки, высушивается в виде пятна на фильтровальной бумаге, затем извлекается и проверяется ДНК.
Два стандартных метода генетического скрининга для определения количества копий SMN1 и SMN2 — это количественная ПЦР (кПЦР) для количественной оценки специфических последовательностей ДНК и мультиплексная амплификация лигатурных зондов (MLPA), которая позволяет выявить отсутствующие или дополнительные фрагменты ДНК.
Более быстрая диагностика СМА с помощью цифровой ПЦР
В Японии текущие программы NBS используют qPCR на образцах сухих пятен крови для обнаружения отсутствующего экзона 7 в обеих копиях гена SMN1 , по одной унаследованной от каждого родителя. Затем MLPA определяет количество копий экзонов 7 и 8 в SMN1 и SMN2 , чтобы поставить окончательный диагноз . Однако этот метод требует много времени и не может обнаружить СМА у пациентов с одной копией SMN1 , например, у тех, у кого делеция экзона 7 SMN1 и другие мутации, вызывающие заболевание.
«Чтобы устранить эти ограничения, существует острая необходимость в методах, которые повышают точность диагностики и сокращают время постановки окончательного диагноза», — пишут исследователи из Университета Кумамото в Японии, которые разработали цифровую систему ПЦР для одновременной оценки количества копий SMN1 и SMN2 с целью сокращения времени диагностики и повышения точности.
Образцы сухих пятен крови были собраны у шести пациентов со СМА и 386 здоровых новорожденных с помощью процедуры укола пятки через четыре-шесть дней после рождения. Для сравнения с цифровой ПЦР, количество копий SMN1 и SMN2 было предварительно определено с помощью MLPA.
Используя цифровую ПЦР, 1,3% здоровых новорожденных имели одну копию SMN1 , 91,2% — две копии, 6,7% — три и 0,8% — четыре. Что касается SMN2 , то у 6,9% здоровых новорожденных не было ни одной копии, у 32,6% была одна копия, у 59,8% — две, у 1,8% — три, и ни у одного не было четырех.
«Метод цифровой ПЦР позволяет точно идентифицировать новорожденных с помощью одной копии экзона 7 SMN 1», — пишут исследователи.
Как и ожидалось, ни при использовании цифровой ПЦР, ни при использовании MLPA ни у одного из шести пациентов не было обнаружено SMN1 , в то время как у троих было две копии SMN2 , а у троих — три копии.
При сравнении цифровой ПЦР с MLPA количество копий SMN1 и SMN2 было одинаковым у всех шести пациентов. Поскольку не было амплификации SMN1 ни в одном образце, чувствительность теста, способность правильно идентифицировать людей с СМА, и его специфичность, способность правильно идентифицировать людей без СМА, составили 100%.
Реагенты, используемые в цифровой ПЦР, менее дороги, чем те, которые используются в количественной ПЦР, «что делает цифровую ПЦР жизнеспособным вариантом для широкого внедрения в программы [скрининга новорожденных] в будущем», — пишут исследователи.
«Это исследование продемонстрировало эффективность использования цифровой ПЦР для [скрининга новорожденных] SMA с [образцами сухих пятен крови]».
